人们已经建立了多种干预方法来控制食品中的腐败或致病菌，例如高静水压、电解氧化水、超声波、辐射、某些化学品或精油。高静水压（HHP）是一种非热食品灭菌和保鲜技术，可以在不损害产品感官质量的情况下减少微生物。在典型的 HHP 程序中，食品被密封并放入装有压力传输介质的钢室中，并使用泵来产生压力。HHP对食品灭菌和保鲜的效果会受到处理压力、处理时间和传压介质的影响传统上，HHP多采用普通水作为传压介质，但也有研究表明，改变传压流体可能会改善HHP的传压介质。HHP 的灭活作用。

近年来，次氯酸/酸性电解水（AEW）被认为是一种有效的消毒剂，并广泛应用于许多国家的食品行业。通过在特定装置中电解，稀释的氯化钠溶液解离成 AEW，其 pH 值较低，为 2-3，氧化还原电位 (ORP) > 1100 mV，活性氯含量 (ACC) 为 10 –90 ppm。与传统消毒剂相比，AEW不仅具有更好的杀菌效果，而且对公众健康和环境的不利影响较小。前期研究证明AEW与其他干预方法相结合可以显着提高其灭活效率。然而，目前还没有研究报道AEW可以作为HHP的新传输介质。此外，AEW 对 HHP 灭活效率的影响尚不清楚。

本研究首次开发了一种利用HHP结合AEW作为新型传输介质的新型灭菌保鲜技术（AEW-HHP）。应用响应面 (RS) 模型来量化 AEW 对高静水压加工的影响，以减少带壳鲜虾的致病菌。并通过去壳鲜虾原生菌群的减少和肌纤维的变化来评价新技术的保鲜效果。这种新颖的灭菌保鲜技术可以为消除病原微生物、提高海产品质量和安全提供有力的工具。

菌株和培养物制备 

副溶血性弧菌菌株（ATCC 17802；ATCC 33847；F 18，凡纳滨对虾分离株；F 36，血清型 O3：K6）的四菌株混合物和单核细胞增生利斯特氏菌（ATCC 19115；ATCC 19116）的两菌株混合物研究中使用。将副溶血弧菌的每种菌株（-80°C 储存于 25% 甘油中）分别在胰蛋白酶大豆肉汤加 3% NaCl 中培养，并在 37°C 下孵育18小时。单核细胞增生利斯特氏菌的其他菌株在 37°C 的 TSB 中生长 18-20 小时。将富集的培养物汇集到无菌离心管中，并在 3000 g、25°C 下离心 10 分钟。将沉淀的细胞重悬于无菌蛋白胨水（PW；0.85% 氯化钠，0.1% 蛋白胨）中，以获得副溶血弧菌和单核细胞增生李斯特菌分别约为 9 log 10 CFU/ mL的多菌株混合物。

虾样品的制备和接种

每次实验前，从海鲜市场购买活的新鲜虾（凡纳滨对虾），并装在塑料袋中运送到实验室，塑料袋中装有充有氧气的池塘水，以保持虾的活力。在实验室，按照GB/T 4789.7-2008（中国国家标准规范，2008）中描述的方案，用自来水冲洗虾。将虾斩首、去皮并在紫外线下消毒30分钟。将去壳鲜虾样品（每只虾 7 ± 1 g）浸泡在 200 mL 含有四种副溶血性弧菌菌株（或两种单核细胞增生李斯特氏菌）的悬浮液中。菌株）30 分钟，然后转移至塑料板 30 分钟以允许细菌附着。上述方案在室温（23±2°C）下进行。接种后的虾用于后续处理。

酸性电解水（AEW）的制备

使用AEW发生器通过电解不同浓度的氯化钠（电解的氯化钠浓度；表1 ）来制备具有不同物理化学特性的AEW。在收集水之前，让发生器运行 15 分钟，电流强度设置为 10 A。pH 和 ORP 使用 pH/ORP 计测定。AEW 中的 ACC 使用数字氯测试套件（RC-2Z，Kasahara Chemical Instruments Corp.，Saitama，Japan）通过比色法测定。所有测量均一式三份进行。AEW 的 pH 范围为 2.28–2.39，ORP 1077–1168 mV，ACC 36–73 mg/L。

表1 BOX-BEHNKEN 实验设计所用变量的代码和级别

高静水压 (HHP) 治疗

本研究使用高压食品加工机。上升速率约为 240 MPa/min，压力释放时间几乎是立即的。将样品包装在无菌塑料袋中，并在所需水平 200、300 或 400 MPa 下进行处理，处理时间为 5、10 或 15 分钟。HHP采用普通水或AEW作为传输介质。

细菌计数

本研究采用的细菌计数方法是根据既往研究的平板计数法。简而言之，将虾样品在胃搅拌器（BagMixer）中均质化 2 分钟。然后，使用直接平板法对虾样品上的副溶血性弧菌、单核细胞增生利斯特氏菌和本土微生物群落进行计数。TCBS 琼脂用于副溶血弧菌，PALCAM 琼脂用于单增李斯特菌分别使用胰蛋白酶大豆琼脂作为本土微生物群。直接平板法的检测限约为 2 log 10 CFU/g。将平板在 37°C 孵育 24 小时后进行菌落计数。每个采样时间进行三次重复。

响应面模型开发和验证

基于 Box-Behnken 实验设计 (BBD) 的 RS 方法用于描述副溶血性弧菌灭活的三个技术变量之间的关系和相互作用（表1 ） 。使用 Design Expert 软件包（版本 8.0.6，Stat-Ease Inc.）设计处理条件（表2），进行回归分析并生成二阶多项式模型。虾样品在不同条件下进行处理（表2），响应值表示为处理后的Log 减少量。

表2 根据 BOX-BEHNKEN 实验设计安排，通过响应面模型对虾副溶血弧菌的实际和预测减少量。

进行方差分析 ( ANOVA ) 和相应的事后对比，以比较不同实验条件的结果。使用确定系数（R 2）、Fisher F检验和失拟检验的P值来评估模型的统计显着性和拟合优度。描述副溶血性弧菌灭活的 RS 模型的准确性通过以下标准进行评估：准确性因子（Af，方程 1）、偏差因子（Bf，方程 2）和均方根误差（RMSE，方程 1） 3

其中obs为观测值，pred为RS模型预测值，n代表观测值的数量。理想情况下，预测模型应具有Af = Bf = 1。响应曲面图和等高线图用于描述变量的个体效应和相互作用。

为了验证该模型，我们进行了八项随机组合四个变量的额外试验（表3）。对虾的细菌灭活方法与之前所解释的灭活处理相同。所选参数在实验设计的原始范围内，但未纳入模型的建立。观察到的结果用于通过Ross (1996)提出的Af（公式 1）和Bf （公式 2）来评估模型的性能。

表3 在额外的随机八个条件下，带壳鲜虾副溶血弧菌灭活的实际和预测减少值。

AEW-HHP处理在人工污染带壳鲜虾上的应用

通过RS方法获得了AEW-HHP对人工污染虾细菌灭活的最佳条件。根据最佳条件，对人工污染的副溶血性弧菌或单核细胞增生利斯特氏菌污染的带壳鲜虾样品进行AEW-HHP处理。处理条件设定为电解氯化钠浓度1.5 g/L，处理时间10 min，处理压力200、300、400 MPa。如上所述通过平板接种测定细菌减少。

扫描电子显微镜 (SEM) 观察

经过AEW-HHP处理后，通过SEM观察人工污染的带壳鲜虾上的细菌。样品的制备和观察均按常规方法进行。简而言之，将处理后的人工污染虾样品用2.5％戊二醛固定，然后在分级乙醇系列中脱水，涂上金钯（离子溅射和碳涂层装置E-1045）并在扫描电子下观察显微镜。

AEW-HHP处理在自然污染带壳鲜虾上的应用

为了进一步验证灭活效果，应用AEW-HHP处理来消除自然去壳鲜虾上的本土微生物群落。处理条件设定为电解氯化钠浓度1.5 g/L，处理时间10 min，处理压力200、300、400 MPa。使用 TSA 对本地微生物区系进行细菌计数。采用PCR-DGGE分析对虾的细菌多样性，并通过组织学分析评价对虾的品质。

使用 PCR-DGGE 进行细菌多样性分析

PCR-DGGE 分析用于评估自然污染虾上细菌多样性的变化。根据Ampe等人描述的方法提取DNA。简而言之，所有样品在胃中均质化 2 分钟。将所得悬浮液(1mL)离心(12,000g，2分钟)，然后弃去上清液。使用DNA提取试剂盒（TIANamp细菌DNA试剂盒）提取获得的沉淀物的DNA。一微升 DNA 样本用作 PCR 模板。引物 V3-2 (5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3') 和 V3-3 包含一个 40 bp GC 夹 (5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCG GGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3')，用于扩增 16S rDNA 的高变 V3 区。就长度和种间异质性而言，V3 区域是一个不错的选择。PCR 混合物由 25 μL Premix Ex Taq 、19 μL ddH 2 O、1 μL 每种引物和 2 μL DNA 模板组成。反应在热循环仪（Mastercycler pro S）上进行。PCR 程序根据Muyzer 等人进行。稍作修改如下：95°C 初始变性 3 分钟；25个循环，95℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸30秒；最后在 72°C 下延伸 5 分钟。扩增产物用 1% (m/v) 琼脂糖凝胶电泳分离，并在紫外灯下可视化。

使用 BioRad DCode™ 通用突变检测系统使用 20 μL 纯化并浓缩的 PCR 产物进行 DGGE。将 PCR 产物涂在含有 40-55% 尿素甲酰胺变性梯度的 1 × TAE 缓冲液中的 8% (m/v) 聚丙烯酰胺凝胶上。恒温（60℃）100V电泳10h。DGGE 凝胶用 SYBR green I 染色并在紫外光下可视化。所有测定均一式两份进行。

使用 Image Lab分析 DGGE 凝胶的扫描图像。香农指数通过 DGGE 带型分析计算。细菌多样性香农指数H ′由式(4)求得。P i按等式(5)计算。

其中P i是凝胶泳道中条带的重要性概率，ni是峰的高度，N是光密度分布中条带的所有峰高度的总和。

组织学分析

根据Liu D.等人的方法进行组织学分析进行了一些修改。切下虾样品的第二个尿节，并在4％福尔马林中固定24小时。将组织用分级系列乙醇（70%、80%、90%、95%和100%）脱水，然后转移到二甲苯中并包埋在石蜡中1-2小时。使用 RM2235 切片机（Leica Microsystems CMS GmbH）获得 7 μm 的组织切片。将切片在水中重塑、干燥、脱蜡、再水合、染色（苏木精-伊红染色）后转移到载玻片上，然后拍照。所有测定均一式三份进行。

根据Díaz-Tenorio 等人的方法对每张图片进行图像分析。空白区域代表肌纤维之间间隙的面积。计算每张图片中空白区域的百分比。结果表示为总分析面积的百分比。

统计分析

所有值均表示为平均值±标准差（SD）。使用SPSS统计软件包17.0（SPSS Inc.）进行统计分析。进行一种方差分析来比较不同条件下的效果。最小显著差异 ( LSD ) 检验用于确定 α = 0.05 时的差异。

表4 带壳鲜虾副溶血弧菌灭活响应面模型的方差分析 ( ANOVA ) 。

图1A中的响应曲面图描述了处理时间为10分钟时氯化钠浓度和处理压力的灭活效果。随着 NaCl 浓度和压力的增加，带壳鲜虾上的副溶血弧菌数量显著减少 ( p < 0.0001)。氯化钠浓度的变化与处理时间在副溶血性弧菌灭活中起着相似的作用，并且细菌对氯化钠浓度和时间的敏感度低于压力（图1B，C）。估计的最佳处理条件是 1.5 g/L NaCl 浓度，在 400 MPa 下电解 10 分钟，最大细菌减少量为 6.08 log 10 CFU/g。

 图 1 响应面图描述了高静水压和 AEW 技术变量相结合对虾副溶血弧菌灭活的影响。(A)处理时间10 min时，氯化钠浓度对电解( X 1 )和压力( X 2 )对副溶血弧菌还原的影响；(B) 300 MPa压力下，电解盐浓度( X 1 )和处理时间( X 3 )对还原副溶血弧菌的影响；(C)压力 ( X 2 ) 和处理时间 (X 3 ) 用电解 1.5 g/L 的 NaCl 浓度还原副溶血弧菌。